In situ -hybridisaatio

in situ -hybridisaatio on menetelmä kromosomaalisten häiriöiden havaitsemiseksi. Tietyt kromosomit on merkitty fluoresoivilla väriaineilla ja sidottu DNA-koettimeen. Tätä tekniikkaa käytetään geenimutaatioiden prenataliseen diagnoosiin.

Mikä on in situ -hybridisaatio?

In situ -hybridisaation tai Fluoresenssi in situ -hybridisaatio nukleiinihapot RNA: sta tai DNA: sta detektoidaan tietyissä kudoksissa tai soluissa molekyyligeneettisillä menetelmillä. Yleensä tämäntyyppistä diagnoosia käytetään havaitsemaan rakenteellinen tai numeerinen kromosomaalinen poikkeavuus raskauden aikana.

Tätä tarkoitusta varten käytetään keinotekoisesti valmistettua koetinta, joka itsessään koostuu nukleiinihaposta. Sitten se sitoutuu organismin nukleiinihappoihin emäsparien muodostumisen kautta. Tämän sidoksen tarkoitetaan termiä hybridisaatio. Todisteet perustuvat potilaan elävään rakenteeseen ja vastaavat siten in situ-todisteita. Tämä on erotettava in vitro -menetelmistä, joissa havaitseminen tapahtuu koeputkessa. Menetelmän kehittivät 1900-luvulla tutkijat Joe Gall ja Mary Lou Pardue.

Teknologia on sittemmin kehittynyt. Vaikka radioaktiivisia koettimia käytettiin tuolloin, esimerkiksi nykyään käytetään fluoresenssileimattuja koettimia, joilla on kovalenttinen sidos markkerimolekyyleihin.

Toiminta, vaikutus ja tavoitteet

In situ -hybridisaatiota käytetään yleensä havaitsemaan kromosomaaliset poikkeamat, ts. Kromosomaaliset poikkeamat, joita ei voida havaita karyogrammissa. Tämä tarkoittaa, että menetelmää käytetään aina, kun perinnölliset sairaudet on määritettävä raskauden aikana.

Koska kromosomipoikkeavuudet ovat ongelma, jota ei pidä aliarvioida nykyään, menetelmän käyttö on lisääntynyt ajan myötä. Hybridisaatio tapahtuu äidin amnioottisen nesteen natiivien solujen perusteella. Teknologian perusta on värimerkitty koettimen sitoutuminen DNA-osiin. Sitoutumisen ansiosta kopiomäärää voidaan myöhemmin arvioida mikroskoopilla, koska yksittäiset kopiot lähettävät valosignaalin ja voidaan siten tehdä näkyviksi mikroskoopin alla. Menetelmiä on erilaisia. Joko analyysi tapahtuu heti sitoutumisen jälkeen.

Tässä tapauksessa käytetään fluoresoivaa väriainetta, kuten biotiinia, joka sitoutuu suoraan DNA-koettimeen. In situ -hybridisaation epäsuoralla menetelmällä arviointia ei voida suorittaa heti hybridisaation jälkeen, koska fluoresoivat aineet voivat sitoutua koettimeen vasta hybridisaation jälkeen. Tätä epäsuoraa menetelmää käytetään useammin kuin suoraa, koska sen uskotaan olevan herkempi. Kromosomispesifisten centrometrin DNA-koettimien lisäksi on myös lokuspesifisiä DNA-koettimia, kromosomispesifisiä DNA-kirjaston koettimia ja vertailevia genomihybridisaatioita.

Kromosomispesifisiä sentrometrin DNA-koettimia voidaan käyttää kromosomaalisten numeeristen poikkeavuuksien havaitsemiseen. Tämä tarkoittaa, että niitä käytetään pääasiassa, kun epäillään toistuvia tai poistettuja kromosomeja. Paikkaspesifiset DNA-koettimet ovat erityisen sopivia sellaisten minimimutaatioiden havaitsemiseksi, joita ei voida havaita karyogrammissa. Kromosomispesifistä DNA-kirjastokoodainta käytetään erityisesti insertioiden ja translokaatioiden havaitsemiseksi.

Genomien vertaileva hybridisaatio puolestaan ​​on kattava analyysi kromosomaalisen materiaalin menetyksistä ja voitoista. Nykyään in situ -hybridisaatio on erittäin tärkeä erilaisten kromosomimutaatioiden diagnosoinnissa.Downin oireyhtymän diagnoosissa koettimet sitoutuvat esimerkiksi kromosomiin 21. Tätä tarkoitusta varten käytetään yleensä kromosomispesifisiä koettimia, joita voidaan käyttää, jos epäillään tätä tautia.

Epäily voi syntyä esimerkiksi jos vanhemmat ovat aikaisemmin synnyttäneet lapsen, jolla on tauti, ja ultraäänikuva on epänormaali. Jos kaksoissidoksen sijasta on kolminkertainen ja siten kolmen värisignaalin annetaan, diagnoosin katsotaan olevan vahvistettu.

Riskit, sivuvaikutukset ja vaarat

Toisin kuin esimerkiksi PCR, in situ -hybridisaatio on huomattavasti vähemmän alttiita kontaminaatiolle. Lisäksi prosessille vaadittava aika on valtavasti vähemmän. Koska erityisesti alkiot muodostavat kromosomimalleja, kuviota ei voida käyttää määrittämään varmasti muun kromosomijakauman ja siten muiden solujen geneettisen tilan.

Värisignaalit voivat myös olla päällekkäisiä tai jäädä näkymättömiksi muista syistä. Seurauksena on, että in situ -hybridisaatio diagnoosityökaluna raskauden aikana on suhteellisen alttiita virheille. Vääriä diagnooseja voi syntyä ja vanhemmat voivat päättää terveestä alkiosta. In situ -hybridisaation virheille alttiuden vähentämiseksi on tutkittava vähintään kaksi alkion solua samanaikaisesti. Tutkimalla kahta solua rinnakkain, väärän diagnoosin riski on nyt vain vähäinen.

Tällöin vanhemmat voivat ehdottomasti luottaa diagnoosiin. In situ -hybridisaatiota ei tarjota jokaiselle raskaana olevalle naiselle, vaan vain riskiryhmän naisille. Siitä huolimatta raskaana oleville naisille ei kielletä tällaista diagnoosia heidän omasta pyynnöstään. Epänormaalit ultraäänihavainnot tai epänormaali seerumi voivat saada lääkärin tarjoamaan diagnostisen toimenpiteen. Vaikka suuri osa kromosomipoikkeavuuksista, mutta ei suinkaan kaikkia, voidaan diagnosoida käyttämällä in situ -hybridisaatiota.

Siksi in situ -hybridisaatiota ei saa koskaan suorittaa yksinään, vaan sitä on käytettävä aina tavanomaisen kromosomitestin yhteydessä. Raskaana olevan naisen hoidolla on tärkeä rooli tässä toimenpiteessä. Ennen analyysia käydään syvälle keskustelua odotettavan äidin kanssa diagnoosimenetelmästä, joka selittää tekniikan riskit, mahdollisuudet ja rajat.